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合作文章丨Small：南京醫(yī)科大學(xué)發(fā)現(xiàn)基于耗竭血清的蛋白冠化材料修飾新策略

發(fā)布時(shí)間：

2023-07-28 15:33:01

南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院霍達(dá)教授課題組于2022年7月1日以全文形式在Wiley旗下材料科學(xué)雜志 Small （IF：15）上在線發(fā)表論文，提出了基于耗竭血清的蛋白冠材料修飾的新策略。唯譽(yù)智合科技（Verygenome Technology）為本研究提供了Labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)支持。

蛋白冠效應(yīng)一直以來就被認(rèn)為是限制納米藥物傳遞功效的最本源的問題。納米材料的蛋白冠效應(yīng)指的是當(dāng)納米材料進(jìn)入體內(nèi)，暴露在血液之后，通過補(bǔ)體激活系統(tǒng)，或者由于疏水，電荷吸引等方式，在材料表面被動的覆蓋一層血清蛋白，這層蛋白與帽子類似，因此被稱為蛋白冠。蛋白冠的存在會改變材料表面原本修飾的配體與既定靶向群體的膜受體之間的作用模式，并且蛋白冠上面的蛋白可以分為兩類，一類是會縮短納米材料在體內(nèi)半衰期的蛋白，稱為調(diào)理素（opsonin），與之對應(yīng)的，另一類是可以增長納米材料在體內(nèi)半衰期的蛋白，稱為逆調(diào)理素（dysopsonin），因此納米藥物的研發(fā)就需要盡可能的去除調(diào)理素，最大程度的保留逆調(diào)理素，從而提高納米藥物的遞送效率，降低其細(xì)胞毒性。

南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院霍達(dá)教授課題組于2022年7月1日以全文形式在Wiley旗下材料科學(xué)雜志 Small （IF：15）上在線發(fā)表論文，提出了基于耗竭血清的蛋白冠材料修飾的新策略。

引入耗盡的血清以產(chǎn)生攜帶不同功能的蛋白冠的納米材料，稱為PCylated納米材料。研究證明利用耗盡的血清對納米材料進(jìn)行鈍化可以有效的降低毒性和促炎反應(yīng)，除此之外，可以利用相同的方法來增強(qiáng)納米材料進(jìn)行內(nèi)吞的能力以及他們作為NF-κB通路激活劑的潛力，而NF-κB的不正確調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)。文章首先合成了五種不同的納米金材料，為了進(jìn)行PCylation，首先對相同的血清進(jìn)行重復(fù)消耗，在此期間收集沉淀物并標(biāo)記，最終創(chuàng)建一個(gè)包含50個(gè)PCylated納米材料的庫（圖1a）。接下來，文章通過透射電子顯微鏡研究表面功能化帶來的潛在變化，發(fā)現(xiàn)所有類型的功能化對納米晶體的形狀和分散性的影響都可以忽略不計(jì)（圖1b）。動態(tài)光散射分析結(jié)果表明，5種納米材料的平均流體動力學(xué)直徑分別增加到82.53±3.19、67.99±0.99、71.65±4.02、44.16±1.00和106.33±2.24nm（圖1c）。為了量化配體密度，文章使用DTNB（5,5'-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸））來可視化PEG的硫醇基團(tuán)，由于DTNB裂解為NTB，硫醇上的PEG與DTNB的加合物會產(chǎn)生光吸附，通過在與納米球孵育之前和之后測量PEG的硫醇濃度，可以量化納米材料消耗的PEG百分比，結(jié)合相應(yīng)的納米球濃度（通過電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)分析的金含量計(jì)算得到），計(jì)算得出每個(gè)球體有364、283、291、642、173個(gè)配體。接下來測量了五種納米材料的Zeta電位值（圖1d），這與之前的報(bào)告一致，證實(shí)了通過使用特定的大分子進(jìn)行表面功能化的這一步驟的成功。

文章接下來通過使用BCA測定法分析通過重復(fù)納米材料暴露的血清消耗效應(yīng)，分析了納米材料的濃度如何影響它們的蛋白質(zhì)消耗能力。發(fā)現(xiàn)納米材料越大，消耗效率越高（對于最高濃度情況下，一次性孵育可能消耗超過20%的蛋白質(zhì)）。為了避免一次性孵育過程中吸附過度或不充分，文章在接下來采用優(yōu)化濃度為61.32μg·mL^-1（約10%的血清蛋白消耗）的納米金材料，圖1e顯示了可視化的濃度熱圖。反復(fù)暴露于包裹有NH2的納米材料會導(dǎo)致最快的消耗（在2次孵育內(nèi)減少47.95%），而對于帶負(fù)電荷或接近中性電荷的對應(yīng)物，盡管在前4次中消耗了更多的蛋白質(zhì)，但此后的蛋白質(zhì)的吸附變得緩慢。根據(jù)前人的研究，正電荷有利于吸附白蛋白和可能的其他型的血清豐富蛋白質(zhì)。通過記錄納米材料庫中每個(gè)組分的紫外光譜（圖1f），研究每一步的消耗變化。發(fā)現(xiàn)在所有組中，剩余蛋白質(zhì)對納米材料的吸引力與消耗時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，此外，加帽分子的長度也會影響蛋白質(zhì)吸附曲線，相對于較短的對應(yīng)物，鏈長較長的PEG可以更有效地保護(hù)納米材料不形成蛋白質(zhì)冠。

為了更好地了解所獲得的PCylated納米材料的特性，文章采用了Labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)研究了10個(gè)代表性樣品的蛋白構(gòu)成。發(fā)現(xiàn)納米材料上的蛋白質(zhì)類型隨著消耗時(shí)間的變化而持續(xù)下降（圖2a），這與蛋白質(zhì)數(shù)量方面的耗盡曲線一致。通過維恩圖分析（圖2b），發(fā)現(xiàn)Au-PEG10k-OMe亞組的第4和第7個(gè)樣品不僅具有相似類型的蛋白質(zhì)，并且共有51類蛋白質(zhì)。對于中性納米材料，它們暴露于原始血清會導(dǎo)致形成以血清中大量蛋白為主的PCylated納米材料。對于這樣的蛋白質(zhì)，它們中的一部分可能會被大量消耗，導(dǎo)致它們在后期被淘汰。鑒于納米材料中血清蛋白：納米材料的比例非常高，這個(gè)階段被稱為“豐富階段”。前期這些蛋白質(zhì)的減少使得那些不太豐富的蛋白與納米材吸附成為可能。接下來就會進(jìn)入“等效階段”，這一階段的蛋白質(zhì)種類只有微小變化。最后，在前兩個(gè)階段沒有被耗盡的蛋白，它們開始接觸到納米晶體，從而形成吸附的后期階段，稱為“耗盡階段”。對于在這個(gè)階段出現(xiàn)的成分，它們數(shù)量較少或表現(xiàn)出與納米晶體的不利結(jié)合（圖2c）。進(jìn)一步評估吸附蛋白的等電點(diǎn)（PI）和分子量（圖2d），觀察到大多數(shù)耗盡的蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，與作為底物的納米晶體無關(guān)。文章將分子量(Mw)高于100kDa的蛋白質(zhì)歸類為大蛋白質(zhì)，而Mw小于15kDa的對應(yīng)物被視為小蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，幾乎20-30%的蛋白冠由大蛋白組成，對小蛋白只有一小部分吸引力（<5%）（圖2a）。維恩圖（圖2e）表明，Au-PEG-OMe-7表現(xiàn)出對蛋白質(zhì)交換的異常穩(wěn)定性（圖2f，2g），進(jìn)一步進(jìn)行了GO分析（圖2h），結(jié)果證明某些類型的蛋白質(zhì)未能吸附到納米晶體上既不是防污效果也不是由于與納米表面的結(jié)合強(qiáng)度不足，而是更可能是由于對納米晶體的可及性差的結(jié)果。唯譽(yù)智合科技（Verygenome Technology）為本研究提供了Labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)支持。

文章通過合成PCylated納米材料庫，全面研究了PCylation策略如何從多個(gè)方面影響納米材料，進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證PCylation用于精密納米療法的潛力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清被納米材料預(yù)吸附數(shù)次之后，再利用它所形成的的蛋白冠，可以削弱原本對細(xì)胞毒性較大的正電性材料造成的損傷，同時(shí)可以增強(qiáng)內(nèi)吞作用，甚至可以幫助其提升對于內(nèi)皮或巨噬細(xì)胞的選擇性，采用經(jīng)過預(yù)吸附的晚期胃癌患者來源血清對納米材料進(jìn)行蛋白冠化修飾，可以提高納米藥物的攝取效率，延緩癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)對正常內(nèi)皮細(xì)胞的影響可以忽略不計(jì)。

文章提出了可以使用源自患者的血清作為一種優(yōu)質(zhì)的生物流體來優(yōu)化納米藥物，對于某些疾病，PCylated納米材料也可能具有無創(chuàng)診斷價(jià)值，文章報(bào)道的方法有助于提高納米藥物的相容性和遞送效率，從而為精準(zhǔn)納米治療服務(wù)。

該研究由南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2020級博士生王嬋完成并以唯一第一作者身份撰文發(fā)表，南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院霍達(dá)教授、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院劉芹教授、江蘇省人民醫(yī)院腫瘤科張皓醫(yī)生為本文的共同通訊作者。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202202002

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